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科学诊断猪衣原体病诊断的技术措施

猪衣原体病诊断的技术措施

猪衣原体病主要是由鹦鹉热衣原体及反刍动物衣原体引起的一种传染病。临床上主要表现为母猪流产、公猪睾丸炎以及仔猪肺炎、胸膜炎、心包炎、脑膜脑炎和结膜炎等症状,给养猪生产带来严重损害。开展猪衣原体流行病学调查、病原生物学、临床症状、病理变化及衣原体关键检测技术研究能为衣原体病的有效防治奠定基础。

1病原

衣原体是一种原核微生物,在自然界广泛存在,能引发人类、鸟类、家畜的眼、关节、呼吸系统、神经系统、泌尿生殖系统疾病。按伯杰氏分类法归为衣原体目。依据DNA的同源性和抗原构造将衣原体分为1属4种,即衣原体属分为:沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体、和反刍动物衣原体。衣原体基因组大小在1.04~1.23Mb之间。上述4种衣原体中,肺炎衣原体只感染人;沙眼衣原体除感染人外还感染猪和鼠;而鹦鹉热衣原体反刍动物衣原体主要引起动物包括猪发病,人也有易感性。衣原体含有DNA和RNA,以二分裂方式增殖,在细胞胞质内可形成包涵体,易被碱性染料着染。用Giemsa、Gimenez、ZiehluNeelsen等染色法着色良好。能在鸡胚和McCoy细胞、鼠L细胞、Hela细胞、Vero细胞、BHK21细胞、BGM细胞、Chang氏人肝细胞内生长繁殖,繁殖过程中会产生两种大小不同的颗粒,较小的为原生小体,直径0.2~0.5μm,呈球形或卵圆形,有传染性。较大的称为网状体,直径0.6~1.6μm,呈球形或不规则形,是繁殖型,无传染性。衣原体含有2种抗原,一种是耐热的,具有属特异性;一种是不耐热的,具有种特异性。鹦鹉热衣原体除含有外膜脂多糖外,还含有一层蛋白质外膜,主要由几种多肽组成,大多数衣原体产生一种毒素物质,其致死作用可用兔或鸡制成的同源抗毒素特异性中和。根据血清型特异性单克隆抗体,鹦鹉热衣原体可分为A~F及M56、WC8个血清型。

2猪衣原体致病性

国内20世纪80年代初曾报道了猪衣原体病,目前已在我国浙江、湖北、江苏、河南、湖南、海南、广东、云南、广西、贵州、四川、甘肃、宁夏、青海、内蒙古等地报道。发病率为5%~95%,猪场多以怀孕母猪流产、产死胎、能繁母猪返情为主要特点。另外据国外资料报道,已从部分病猪中检出了鹦鹉热衣原体和反刍动物衣原体,猪的感染率也高达74%,其中英国猪群的感染率为23%,但不同年龄的畜禽其症状因病毒毒力的强弱差异而表现不一。

3临床症状

猪衣原体病症状的严重程度差异很大,常因菌株毒力,猪性别、年龄、生理状况和环境的变化而出现不同的症候群。病猪主要表现为精神沉郁,不愿站立或走动,厌食,便秘,体温升高至38.5~41.5℃。呼吸急促,气喘或咳嗽,眼结膜潮红并有分泌物。母猪可表现流产、产死胎或弱仔,一般流产发生于怀孕后期,流产率20%~90%不等。分娩后胎衣滞留,有的继发感染细菌性子宫内膜炎而死亡。患病公猪精神不振,睾丸肿大,触摸有热、痛感。公猪发生睾丸炎、副睾炎、阴茎炎、尿道炎;仔猪常表现为鼻流浆液黏液性分泌物、流泪、咳嗽、呼吸困难、腹泻、关节肿胀、消瘦、衰竭死亡。

4病理变化

本病多发生在初产母猪,怀孕后期突然发生流产、早产、产死胎或弱仔。流产母猪均有不同程度的胎膜水肿,腹腔积液。胎儿水肿,其皮肤上有淤血斑,肝肿大,心内膜有出血点,脾肿大。组织学检查发现胎儿肝、肺、肾、心和骨骼肌有弥漫性和局灶性网状内皮细胞增生变化;仔猪常表现为卡他性胃肠炎,肠系膜和淋巴结肿胀充血。肝与大肠、小肠及腹膜发生纤维素性粘连。肺有灰红病灶,有时见有胸膜炎。关节浆液性发炎,内有大量浅棕色液体,从纤维层一直到邻近肌肉发生水肿,充血、出血。患脑脊髓炎的猪病初常在腹腔、胸腔和心包有浆液渗出,以后浆膜面被纤维素性薄膜覆盖,脑膜和中枢神经系统血管充血,组织学检查见脑和脊髓的神经原变性,坏死,并有淋巴细胞浸润。

5诊断

5.1光学显微镜检查

无菌采集病料,包括血液、病变脏器、流产胎儿及各种分泌物制片,用Gimenez染色,包涵体中原生小体呈红色或紫红色,网状体呈蓝绿色。病理组织切片中能观察到组织细胞胞浆中衣原体包涵体,呈圆形或不规则形。

5.2细胞分离法

用无衣原体抗体的胎牛血清和对衣原体无抑制作用的抗生素,如万古霉素、硫酸卡拉霉素、链霉素、杆菌肽、庆大霉素和新霉素,制成标准组织培养液培养出盖玻片单层细胞,然后将病料悬液0.5~1.0mL接种于细胞,2~7d后取出感染细胞盖玻片,Gimenez染色镜检。取出盖玻片,用PBS洗2~3次,风干,用无水甲醇固定后,用于碘染色(包涵体呈棕褐色)或姬姆萨染色,或用丙酮固定后用荧光抗体染色,阳性即可确诊。

5.3鸡胚分离法

将样品悬液0.2~0.5mL接种于6~7日龄鸡胚卵黄囊内,在39℃孵育。接种后3~10d内死亡的鸡胚卵黄囊血管充血。无菌取鸡胚卵黄囊膜涂片,若镜检发现有大量衣原体原生小体则可确诊。

5.4小鼠接种

将病料经腹腔(较常用)、脑内或鼻内接种3~4日龄小鼠。腹腔接种后小鼠腹腔中积累纤维蛋白渗出物,脾脏肿大,镜检时可取腹腔渗出物和脾脏。脑内和鼻内接种小鼠可制成脑膜、肺脏印片。

5.5碘技术及药敏试验

鹦鹉热衣原体对四环素族抗生素、红霉素、青霉素敏感,对链霉素和氨基苯甲酸不敏感;而沙眼衣原体能被磺胺嘧啶钠所抑制,因此药敏试验可对其鉴别。此外,由于沙眼衣原体包涵体内含有碳水化合物,碘染法时出现蓝色颗粒,因而可利用碘技术即碘与糖原结合被染成蓝色进行检测。这两种方法为鉴别衣原体种类提供依据。

5.6血清学诊断方法

(1)补体结合试验(CFT)。此法要求抗原及血清必须是特异性的,补体血清必须来源于无衣原体感染动物。但血清与相应抗原结合后不能与补体结合,就会出现假阳性结果。关于改良CFT,即向补体中加入50mL新鲜的正常血清,如鸡血清,可用于检测来自不能正常与补体结合的抗体的血清,以提高其敏感性。

(2)间接血凝试验(IHA)。IHA是用纯的衣原体致敏绵羊红细胞后用于猪血清中衣原体抗体检测此法简单快捷、敏感性较高。国内外都已广泛使用血凝诊断试剂盒,但有些血凝诊断盒存在批次间差异较大、阳性检出率较低现象。

(3)免疫荧光试验(IFT)。若标记抗体的质量很高,可提高检测衣原体抗原或抗体的灵敏度和特异性而用于临床定性诊断。微量免疫荧光法(MIF)可提高诊断滴度标准但不能提高其特异性。关于改良衣原体荧光检测法,即将标本涂于载玻片上,然后甲醇固定10min后将荧光抗体染液滴于标本上,置湿盒中37℃30min后冲洗、晾干,镜检。改良后用过氧化氢的氧化作用加速抗原抗体反应,缩短了试验过程。

(4)酶联免疫吸附试验(ELISA)。采用ELISA技术和原理研制的双抗夹心酶标法,多用于检测猪流产胎儿衣原体。其灵敏度及检出率高,特异性好,有助于衣原体病的早期诊断和流行病学调查。沙眼衣原体快速检测目前分定性和定量快速检测是采用双抗体夹心方式建立胶体金免疫层析技术。用于生殖系统的金标法定性检测衣原体也具有快速、方便、准确性高的优点。

(5)单克隆抗体技术(MAbs)。用禽源分离株血清型特异性单克隆抗体可鉴定鹦鹉热衣原体,国外已经研制出抗6种血清型的鹦鹉热衣原体单克隆抗体,用于新分离株的血清分型研究。此外,利用单克隆抗体、目前主要有用衣原体外膜蛋白的单克隆抗体的商品试剂。

5.7聚合酶链式反应(PCR)

聚合酶链式反应能对种进行鉴定。目前国外学者已成功应用衣原体的主要外膜蛋白基因、热休克蛋白、脂多糖为靶基因序列,通过运用PCR与DNA杂交技术及Real-TimePCR等技术实现衣原体的检测。试验证明,月桂酰肌氨酸钠和十二烷基磺酸钠分步处理衣原体EB是获取高浓度MOMP的理想方法,通过PCR技术能检测鹦鹉热衣原体外膜主蛋白编码基因序列在不同菌株之间的差异。最近国外建立了鹦鹉热种特异性PCR,用于检测衣原体的MOMP基因区中的靶序列,通过对样品进行前PC处理,以获得短的DNA片断进行扩增,或用套式PCR扩增,以提高其敏感性。转录介扩增法(TMA)是一种恒温扩增核酸的方法,需要RNA逆转录酶和RNA聚合酶。在理论上可以把靶基因扩增倍。将特异荧光标记的DNA探针与RNA扩增产物进行杂交保护试验后检测出荧光即可。连接酶链反应是将32P标记的寡核苷酸掺入反应体系,对扩增产物进行凝胶电泳后进行放射自显影,是一种探针扩增反应,是依赖靶核苷酸序列的寡核苷酸探针的连接技术。LCR由于使用两对引物,较PCR具有更高的敏感性和特异性。

中心分布

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